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巧用无缝克隆做点突

发布时间:2018-10-16 12:17 |  点击次数:

巧用无缝克隆做点突

实验目的:

      利用无缝克隆技术进行多点突变。以突变Sgsc基因内部两个位点R50H (AGA-CAT)和L573Q(TTA-CAA)为实验例。

实验方法:

       根据无缝克隆(Seamless Cloning)技术原理,设计具有载体同源重组序列和点突变的引物,通过PCR技术扩增出突变片段,然后将突变片段与线性化载体进行重组连接。

实验试剂及材料:

       2×Seamless Cloning Mix(货号:CL117-01);2×Xerox PCR MasterMix (含染料)(货号:MT209-01);琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(货号:DH101-01);PCR管0.2 ml(货号:QB0201);NEB10-beta感受态细胞(货号:BC113-01);BM2000+ DNA Marker(货号:MD102-01);去离子水(货号:SH408-01);氨苄青霉素钠盐(货号:SH101-01);LB 培养基固体平板(含100 μg/ml氨苄青霉素)(货号:SH205-01);50×TAE Buffer(货号:EL102-01);琼脂糖 西班牙(货号SH5301-01);高纯度质粒快速提取试剂盒(货号:DP102-01);2×Fast Taq PCR MasterMix(含染料)(货号:MT202-01);引物合成(本公司提供引物合成服务);DNA测序(本公司提供DNA测序服务);PCR仪;离心机;超净工作台;电泳仪等。

实验步骤:

01 线性化载体的制备

    为了提高克隆效率,最好通过酶切或PCR扩增空载体的方法来制备线性化载体。

(1)酶切制备线性化载体时,最好使用双酶切法,双酶切体系如下:

成分

体积

内切酶Buffer(10×)

5 μl(终浓度1×) 

空载体质粒(pCEV 1 μg/μl)

5 μl        

Sal Ⅰ

2 μl

BamH Ⅰ

2 μl

去离子水

to 50 μl

37℃,酶切2小时,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和切胶回收。【建议加到4个孔中(13齿,100 ml的胶)】

【琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(货号:DH101-01)】

(2)如果通过PCR扩增的方法制备线性化载体,PCR产物可使用DpnⅠ(货号:CL304-01)消化甲基化的载体模板,再进行切胶回收。

02 设计引物

    首先将待突变的序列整理好,把需要突变的位点在序列中标出并制作突变位点信息表格,一方面便于设计突变位点处的重组引物,另一方面构建完成后,在待突变序列上作突变修改后和质粒测序结果进行比对。

   制作突变位点信息表格:

 

野生型位点序列

突变型位点序列

R50H

R(AGA)

H (CAT)  

L573Q

L(TTA)

Q (CAA) 

*“50”代表第50位氨基酸;“573”代表第573位氨基酸。

※注意:方框区黑色字体序列为pCEV载体无缝克隆的同源区。下划线区为突变位点处的同源区域。

根据以上信息设计引物:

含有同源重组序列的引物

reCEVF:GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAG

reCEVR:TTCGGAAATCAACTTCTGTTCCATG

含有点突变的引物

50HF:ATTGTTGCAAGTTCATAAAGCTCATAAAGCTTTTCATGATGATAGA

50HR:TCTATCATCATGAAAAGCTTTATGAGCTTTATGAACTTGCAACAAT

573QF:CATCTGCAACAATGGAGGCACAAACATTATTCAAGAAGTTAC

573QR:GTAACTTCTTGAATAATGTTTGTGCCTCCATTGTTGCAGATG

(1) 片段1 (210 bp)

reCEVF:GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAG

50HR:TCTATCATCATGAAAAGCTTTATGAGCTTTATGAACTTGCAACAAT

(2) 片段2 (1613 bp)

50HF:ATTGTTGCAAGTTCATAAAGCTCATAAAGCTTTTCATGATGATAGA

573QR:GTAACTTCTTGAATAATGTTTGTGCCTCCATTGTTGCAGATG

(3)片段3 (611 bp)

573QF:CATCTGCAACAATGGAGGCACAAACATTATTCAAGAAGTTAC

reCEVR:TTCGGAAATCAACTTCTGTTCCATG

PCR扩增

 (1)PCR扩增体系:

为避免回收浓度不高,胶孔漏液等因素,建议扩增3管即150 μl。

【2×Xerox PCR MasterMix(含染料)(货号:MT209-01)】

(2)PCR循环设置:

 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和切胶回收。

【琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(货号:DH101-01)】

04 突变片段与载体的重组连接  

在一个0.2 ml的PCR管中建立重组克隆体系: 

成分

体积

2×Seamless Cloning Mix

5 μl(终浓度1×)

片段1  (50-80 ng/μl)   210 bp

1 μl

片段2 (50-80 ng/μl)  1613 bp

1 μl

片段3  (50-80 ng/μl)   611 bp

1 μl

载体pCEV (50-80 ng/μl)   6540 bp

1 μl

去离子水

to 10 μl

轻轻混合,离心数秒,50℃,连接15分钟。         

05 转化

(1)从-80℃冰箱中拿出感受态细胞,放于冰上溶解;

(2)取5-10 μl连接产物加入到刚化冻的50 μl或100 μl NEB10-beta感受态细胞中, 轻轻混匀;

(3)冰上静置20-30 min;

(4)42℃,热击90 sec;

(5)冰上放置2 min;

(6)加入900 μl无抗性的LB液体培养基,200 rpm,37℃,培养60 min;

(7)室温离心1 min,弃掉900 μl上清,用100 μl LB轻轻悬浮沉淀,取50 μl 菌液 涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基固体平板(pCEV载体为氨苄青霉素抗性)。剩余的菌液可放在4℃,看生长状况决定去留。

(8)37℃,倒置培养过夜。

06 阳性克隆鉴定

(1)菌落PCR方法;

(2)限制性酶切分析方法;

(3)DNA测序方法。

 

07 突变后的测序结果

(1)R50H突变位置峰图:

 GTTCATAAAGCTCATAAAGCTTTTCATGATG

(2)L573Q突变位置峰图:

     AACAATGGAGGCACAAACATTATTCA

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